Western Blot (WB)

Time：2024-07-01 20:47:20

Western tests are often used to quantitatively or qualitatively determine protein expression in tissues or cells. The steps of Western experiment are complicated, and every detail in the experiment will have an impact on the result. Today, Boyan Biology will share with you the practical operation experience over the years.

Operate video

Protein extraction → protein quantification → loading, electrophoresis → membrane transfer → closure → incubation of primary antibody → incubation of secondary antibody → chemiluminescence detection

List of experimental products

Experimental procedure

第一步：选择抗体

注意事项：

1. 蛋白是否有修饰；

2. 蛋白的表达情况；

3. 蛋白是否有可变剪接体；

4. 确定目的蛋白的分子量，选择合适浓度的凝胶。

第二步：蛋白提取

1.配置裂解液：预估样本总量准备裂解液。每1ml裂解液加入10ul的蛋白酶抑制剂和10ul的磷酸酶抑制剂 

2.贴壁细胞：用细胞刮，刮下细胞，将含有细胞的培养液转入离心管悬浮细胞：轻轻摇晃培养瓶，将含有细胞的培养液转入离心管

3.离心，3000rpm，3min

4.弃掉培养液，加入1ml 预冷的PBS洗涤液，漂洗两次，将含有细胞的洗涤液转入EP管，

离心，3000rpm，5min

5.弃掉洗涤液， 按照每10ul细胞沉淀加入100ul裂解液的比例加入裂解液，充分混匀，置于冰上裂解30-60min 

6.组织：取适量组织，称量，按照每0.1g的组织加入1ml裂解液的比例加入含有酶抑制剂的RIPA裂解液             

7.充分研磨 

8.将匀浆液转入离心管，冰上裂解30-60min  

9.超声破碎

10.离心，10000rpm，10min   

11.取上清 

注意事项：

1.实验过程中尽量让样本处于低温环境；

2.提取液避免不必要的成分，建议使用RIPA裂解液；

3.建议超声处理裂解后的蛋白样品，使蛋白定量更准确，蛋白条带更清晰，背景更干净（超声时间2秒，间歇2秒，功率100-200瓦）。

第三步：蛋白定量

1.制备标准曲线，加入代测样本

2.加入显色剂

3.37℃孵育30min 

4.酶标仪测定OD值

5.制作标准曲线，计算蛋白浓度

注意事项：

1.实验前蛋白定量必须做；

2.每次蛋白定量都要新鲜配置标准曲线；

3.选择定量前要了解每种方法的使用禁忌，比如BCA法禁止裂解液中有高浓度的还原剂和金属螯合剂。

第四步：蛋白变性

在样品中加入上样缓冲液，90-100℃沸水浴3-5min 

注意事项：

1.对于多重跨膜的蛋白，建议70℃加热10min；

2.变性蛋白在-20℃可保存至少2个月；

3.避免样本反复冻融；

4.加入一定体积的上样缓冲液，使各样本最终浓度保持一致，一般调至3mg/ml，上样量10ul。

第五步：凝胶制备

1.装好玻璃    

2.配制分离胶 

3.灌入分离胶，加水压平，水平静置30min 

4.凝胶聚合后，倒出蒸馏水，滤纸吸干

5.配制浓缩胶

6.灌入浓缩胶，插入梳子，水平静置30min

注意事项：

1.确保分离胶的PH8.4-8.8,浓缩胶的PH6.8；

2.过硫酸铵尽量新鲜配置；

3.凝胶需要缓慢凝固，否则会导致胶太硬造成烧胶；

4.TEMED有毒易挥发，尽量在通风橱中进行操作，根据温度适量增减，15-25℃按正常量加。

第六步：蛋白上样

1.装配电泳架

1. 倒入电泳液

2. 加入样品

注意事项：

1. 20-50μg/孔细胞，组织提取总蛋白，5-10ng/孔重组蛋白；

2. 尽量保持每个泳道的蛋白量一样，体积尽量一致；

3. 空置的泳道用等体积的上样缓冲液补齐。

第七步：蛋白电泳

1. 电压80V，开始电泳

2. 溴酚蓝跑到浓缩胶与分离胶交接处，调节电压至120V

3. 待溴酚蓝跑至凝胶底部0.5cm处，停止电泳  

注意事项：

1. 在时间允许的条件下，电泳时间不尽量慢一些；

2. 电泳液不建议重复使用；

3. 蛋白Marker并不是100%准确，一般有5%左右的误差。

第八步：蛋白转膜

1.制作转印夹：割胶，按照纤维垫-滤纸-凝胶-NC膜-滤纸-纤维垫依次放好 

2.将转印夹放入转印槽，倒入转膜液

3.转膜，150mA,70min

注意事项：

1.建议蛋白湿转；

2.大分子蛋白（大于200kd），可以将甲醇含量降到5-10%；

3.转膜结束后可以用丽春红检测转膜结果，单纯看Marker是否转到膜上来     判断成功与否并不准确；

4.恒流150mA/槽转膜，8%转80min，10%转70min，12%转50min。

第九步：封闭

1. 取出转好的NC膜，放入洗涤液中

2. 洗涤10min，重复3次

3. 倒掉洗涤液，加入封闭液，室温封闭90min

注意事项：

1. 建议使用实验级脱脂奶粉，一般的脱脂奶粉中的防腐剂会干扰抗原抗体的结合；

2. 封闭液最好是新鲜配置。

第十步：抗体孵育

1.倒掉封闭液，加入一抗

2.放入冰箱，4℃孵育过夜

注意事项：

1.建议使用专用抗体稀释液，有效减少一抗的非特异性结合，有效提升稀释后一抗的稳定保存时间；

2.建议过夜孵育抗体，抗原抗体反应更充分。

第十一步：洗涤

1. 倒掉一抗，洗涤10min，重复3次；

2. 倒掉洗涤液，加入二抗，室温孵育120min；

3. 倒掉二抗，洗涤10min，重复3次。

注意事项：

1. 建议使用TBS-T洗涤，对于某些抗体，TBS-T比PBS-T可以产生更强的信号；

2. 洗涤次数不宜过多，容易造成膜上蛋白丢失，也不宜过少，容易造成高背景，一般建议10min。

第十二步：检测

1. 将NC膜放入发光显色仪

2. 将配置好的发光底物覆盖NC膜

3. 化学发光成像仪，机器曝光成像

注意事项：

1. 化学发光法建议使用灵敏度高的发光液检测，可以尽量避免低丰度的蛋白出现假阴性；

2. 由于荧光法提供了多通道WB的可能性，可同时检测磷酸化蛋白和总蛋白，不用分子量的多种蛋白可同时检测，但要注意由于表位的重叠导致无法使用。

Experimental frequently asked Questions

1.高背景

2.信号弱或无信号

3.非特异性条带

4.弥散型条带