Immunohistochemistry (IHC)

Time：2024-07-02 14:00:30

Immunohistochemistry (IHC) is a commonly used pathology technique to show the presence, location, and content changes of proteins through tissue staining, and is the main immunoassay method in many laboratories. Pathology experiment seems easy, but there are many variables in the experiment process, and it takes a long time to accumulate and explore experience to really do it well. Boyan biology will share with you the experience of practical operation over the years.

Operate video

Fixation → sectioning → dewaxing to water → inactivation → antigen repair → sealing → primary antibody incubation → secondary antibody incubation → color development → restaining → sealing

List of experimental products

Experimental procedure

第一步：切片

1. 石蜡切片厚度5微米；

2. 40℃水温展平组织后防脱玻片捞片；

3. 60℃烘箱，烤片30min。

注意事项：

对于骨或皮肤这些易脱片的组织，可适当延长烤片时间。

第二步：脱蜡至水

1. 二甲苯脱蜡，3缸，每缸10min；

2. 100%、85%、70%酒精，各浸泡10min。

注意事项：

具体时间需根据室温和二甲苯的新旧程度灵活调整，室温越高，二甲苯越新，相应浸泡时间越短，以组织上无点状石蜡残留为准。

第三步：灭活 

1. 滴加内源性过氧化物酶阻断液；

2. 室温孵育10min；

3. PBS缓冲液水洗3次，每次5min。

注意事项：

对于内源性过氧化物酶含量高的组织，可以适当延长孵育时间或增加过氧化氢浓度。

第四步：抗原修复

EDTA微波热修复5~8min，冷却至室温。

注意事项：

对大部分蛋白来说，EDTA修复液一般都能得到满意的结果。也可使用传统的柠檬酸盐修复液。样本固定时间过久或阳性表达不强，可以适当增加修复的次数和强度。

第五步：封闭

1. 免疫组化笔画圈，防止试剂流出；

2. 滴加5%BSA或者封闭血清；

3. 37℃孵育30min。 

第六步：孵育一抗

1. 甩去多余液体，不洗，直接滴加一抗；

2. 37℃孵育1-2h；

3. PBS缓冲液清洗3遍，每次5min。

注意事项：

初次实验，建议一抗做浓度梯度，以确定最佳的一抗稀释比例。

第七步：孵育二抗

1. 滴加HRP标记羊抗兔；

2. 37℃孵育30min；

3. PBS缓冲液清洗3遍，每次5min。

注意事项：

根据一抗种属决定二抗的类型，比如一抗为兔抗，那二抗选择HRP标记的羊抗兔IgG。

第八步：显色

1. 配置DAB，1ml B液+1滴A液，混匀；

2. 滴加DAB显色液；

3. 镜下观察，控制显色时间；

4. 终止反应；

5. 水洗。

第九步：苏木素复染

1. 苏木素复染40s；

2. 蒸馏水水洗；

3. 返蓝液浸泡1min；

4. 水洗。

第十步：封片

1. 70%、85%、100%酒精梯度脱水，每缸3min；

2. 二甲苯透明，三缸，每缸3min；

3. 晾干后，中性树胶封片，观察实验结果及拍照。

Experimental frequently asked Questions

1.无染色

2.高背景

3.   非特异性染色